کشت بافت خرما

کشت بافت خرما : پروتکل و دستورالعمل تکثیر به روش کشت بافت

کشت بافت خرما روشی است که با استفاده از تکثیر سلول های غیرجنسی گیاه، نهال مثمر نخل خرما در مقیاس انبوه تولید می شود. از آنجایی که تکثیر نخل خرما به روش سنتی یعنی کاشت پاجوش بسیار زمان بر و دارای تلفات بسیار است، کشت بافت تنها روش ایمن و سریع تکثیر انبوه این گیاه نیمه گرمسیری است. مجول کشت بافت و برحی کشت بافت در گروه نهال های گران و پرطرفدار خرما در جهان است.

برای درک بهتر اهمیت تولید درخت خرما به روش کشت بافت، بهتر است ابتدا مطلب تولید نهال نخل خرما را به دقت بخوانید تا کلیه روش های تولید این درخت بسیار با ارزش گرمسیری را نیز مرور کرده باشید. دو روش اصلی برای تولید نهال خرما به روش کشت بافت و ریزازدیادی وجود دارد:

• Organogenesis پروش اندام زایی
• Direct Somatic Embryogenesis روش جنین زایی مستقیم

اهداف کلان استفاده از کشت بافت

• توسعه نخلستان‌ های تجاری یکدست: ایجاد باغ‌ های متراکم و پربازده با عملکرد یکسان.

• حفظ ذخایر ژنتیکی: تکثیر و نجات ارقام اصیل، نادر یا در معرض انقراض.

• صادرات: تولید نهال‌ های استاندارد و دارای گواهی سلامت برای بازارهای جهانی.

• شتاب در برنامه‌ های اصلاح نژاد: تکثیر سریع ژنوتیپ‌ های برتر حاصل از تلاقی.

پیش‌ نیازها و امکانات ضروری

الف) آزمایشگاه مجهز کشت بافت

• هود لامینار فلور (جریان هوای استریل)

• اتوکلاو (برای استریلیزاسیون محیط کشت و ابزار)

• اتاقک رشد (قابل تنظیم دما، رطوبت، نور و فتوپریود)

• انکوباتور (برای مراحل خاص)

• دستگاه pH‌ سنج و ترازوی حساس

• یخچال و فریزر برای نگهداری مواد

• ابزار جراحی استریل (اسکالپل، فورسپس، پنس)

ب) مواد شیمیایی و محیط کشت

• محیط کشت پایه: عمدتاً محیط MS (Murashige and Skoog) یا انواع اصلاح‌شده آن.

• هورمون‌ های گیاهی (تنظیم‌کننده‌های رشد):

  • اکسین‌ ها: مانند NAA, IBA, IAA (برای ریشه‌ زایی)

  • سیتوکینین‌ ها: مانند BAP, Kinetin (برای تحریک جوانه‌ زایی)

  • جیبرلین‌ها: مانند GA3 (برای طویل شدن ساقه)

• مواد جامد کننده: آگار

• مواد ضدعفونی کننده: هیپوکلریت سدیم، الکل، محلول‌ های قارچ‌کش و آنتی‌ اکسیدان (اسید سیتریک و اسید اسکوربیک).

ج) منبع گیاهی (درخت مادری)

انتخاب درخت مادری برتر با ویژگی‌های زیر حیاتی است:

• سلامت کامل (عاری از هرگونه بیماری و آفت)

• عملکرد کمی و کیفی بالا و ثبت‌ شده.

• دارا بودن صفات مطلوب تجاری (مانند اندازه میوه، ماندگاری، مقاومت)

• پاجوش‌ های انتخابی باید از درختی با سن مناسب (۱۰-۱۵ سال) و در فصل خواب فیزیولوژیک (زمستان) جدا شوند.

آموزش کشت بافت خرما

تولید نهال خرما به روش کشت بافت 

مراحل مختلف آزمایشگاهی کشت بافت خرما به ترتیب به شرح ذیل است:

مرحله اول: آماده سازی (تهیه) ریزنمونه Preparation

ریزنمونه یا ماده ژنتیکی در واقع همان سلول های غیرجنسی اولیه هستند که از پاجوش های درختان مادری گرفته می شوند. پاجوش ها در فصل سرد سال که درخت حداقل فعالیت فیزیولوژیکی را دارد از درخت مادری جدا می شوند. پاجوش هایی با سن دو سال به بالا که حدود ۲۰ تا ۲۵ کیلوگرم وزن و ۱.۵ متر ارتفاع داشته باشند، بهترین گزینه برای جدا سازی هستند.

پس از انتقال پاجوش به آزمایشگاه اندام های اضافی باقی مانده مانند شاخه ها را جدا کرده و کف پاجوش را با دقت برش زده، جدا کنید و دور بیاندازید. اکنون باید از پاجوش چیزی حدود حداکثر ۵۰ سانتی متر باقی مانده باشد. سپس شاخه حاصل را تا زمانی که به یک بافت نرم سفید رنگ برسید برش دهید. دقت کنید شاخه حتما باید پایه لیگنینی شده است را حفظ کند. در نهایت باید به ریزنمونه ای برسید که ۶ تا ۸ سانتی متر طول و ۳ تا ۴ سانتی متر عرض داشته باشد.

مرحله دوم: ضدعفونی کردن ریزنمونه Disinfection

اکسپلنت Explant یا همان ریزنمونه با پایه لیگنینی را در محلول آنتی اکسیدان حاوی ۱۵۰ میلی گرم در لیتر اسید سیتریک و ۱۰۰ میلی گرم در لیتر اسید اسکوربیک قرار دهید. یکی از وظایف مهم این محلول نگهداری ریزنمونه تا زمان کشت و محافظت از آن در برابر قهوای شدن (فنل زدگی) است. در مرحله بعدی، نوک ریزنمونه را به مدت ۲۰ دقیقه با محلول قارچ کش مانند مانکوزب استریل کرده و سه بار با آب مقطر اتوکلاو شده شستشو دهید. سپس ریزنمونه را در محلول هیپوکلریت سدیم ۹% NaOCl همراه با چند قطره تویین ۲۰ به مدت ۵ دقیقه در خلا و همچنین به مدت ۲۰ دقیقه در فشار معمولی فرو ببرید.

مرحله سوم: شروع کشت Initiation

محیط کشت اولیه شامل محیط کشت MS معمولی حاوی مقدار کمی یون آمونیوم همراه با تنظیم کننده های رشدی (هورمون های گیاهی) ۰.۳ تا ۰.۱ میلی گرم در لیتر می باشد. حتما دقت داشته باشید Ph محیط کشت قبل از افزودن آگار و اتوکلاو کردن روی ۵.۷ تنظیم شده باشد. پس از آماده سازی محیط کشت، ریزنمونه را در جریان ملایم هود لامینار از محلول درآورده و بدون هیچ شستشویی مستقیما داخل محیط کشت قرار دهید. پس از کاشت، مرحله تلقیح آغاز می شود که باید ریزنمونه ها بین ۳ تا ۴ هفته در اتاق رشد تاریک قرار بگیرند. سپس با توجه به میزان موفقیت آمیز بودن تلقیح، ریزنمونه ها در فتوپریود (دوره ی نوری) ۱۶ ساعته قرار می گیرند.

مرحله چهارم: تکثیر Multiplication

محیط کشت این مرحله مشابه مرحله Initiation است اما تفاوت اصلی در هورمون ها و غلظت های به کار رفته در آن ها است. در این مرحله از هورمون های سیتوکینین, مثل BAP با محدوده غلظت ۰.۵ تا ۵ میلی گرم در لیتر استفاده می کنیم. مهمترین کار در این مرحله جداسازی گیاهچه های توسعه یافته از جوانه های دیگر است زیرا گیاهچه های رشد یافته از رشد سایر گیاهچه های بالقوه جلوگیری می کنند.

مرحله پنجم: ریشه زایی و ساقه زایی Rooting and Elongation

پس از گذشت مدت زمان کافی که بسته به نوع واریته خرما می تواند از چند هفته تا چند ماه طول بکشد، گیاهچه هایی که توسعه بهتری داشتند به محیط ریشه زایی منتقل می شود. محیط ریشه زایی محوریت اکسین ها ساخته می شود. ترکیب هورمون های پیشنهادی برای خرما شامل: (نوع محیط کشت به همراه غلظت هورمون های پیشنهادی)

• محیط کشت MS
• NAA به میزان ۱ میلی گرم در لیتر
• BAP به میزان ۰.۵ میلی گرم در لیتر
• Kinetin به میزان ۰.۵ میلی گرم در لیتر
• GA3 به میزان ۰.۵ میلی گرم در لیتر

در تحقیقات انجام شده هورمون NAA کارایی و عملکرد بهتری نسبت به هورمون های IBA و IAA در ریشه زایی خرما نشان داده است. ریزنمونه ها برای حدود ۱۰ تا ۱۵ روز باید در این محیط قرار بگیرند. پس از گذشت این مدت با توجه به نوع واریته خرما و میزان توسعه یافتگی در محیط کشت قبلی به محیط کشت مشابهی با غلظت های متفاوتی از تنظیم کننده های رشدی گیاه منتقل می شوند.

مرحله ششم: سازگاری Acclimatization

برای اینکه متوجه و مطمئن شویم آیا زمان مناسب برای انتقال گیاهچه ها به مرحله سازگاری فرا رسیده است یا خیر باید به نکات زیر توجه کنیم:

• گیاهچه ها باید دو تا سه برگ بزرگ و سالم بدون پیچ خوردگی داشته باشند.
• ساقه باید ارتفاعی حدود ۱ تا ۱۰ سانتی متر از پایه تا برگ ها داشته باشد.
• پایه ساقه باید فرمی تاجی-گلابی داشته باشد.
• سیستم ریشه ای باید حداقل ۵ سانتی متر طول داشته باشد.

ریزنمونه یا گیاچه ای دارای همه ویژگی های ذکر شده در بالا باشد، آماده سازگاری است. اولین قدم برای شروع مرحله سازگاری شستشوی ریشه ها با آب مقطر است تا آگار و محیط کشت پسبیده به ریشه کاملا حذف شود، سپس برای جلوگیری از حملات قارچی با استفاده از محلول قارچ کش بنلات ۰.۵ درصد، گیاهچه ها ضدعفونی می شوند. در انتها باید گیاهچه ها را در محیط ریشه زایی مناسب مثل پیت ماس و کوکوپیت و در رطوبت مناسب داخل گلخانه قرار دهید.

کشت بافت خرما یک فناوری پیچیده اما بسیار سودمند است که نیازمند دقت علمی، تجربه عملی و مدیریت دقیق در تمام مراحل است. موفقیت در این فرآیند مستلزم بهینه‌ سازی پروتکل برای هر ژنوتیپ خاص خرما می‌باشد. با تسلط بر این روش، می‌توان به پایه‌ریزی یک صنعت پیشرفته و سودآور تولید نهال خرما در سطح ملی و بین‌المللی امیدوار بود.

هشدار: این پروتکل یک چارچوب کلی علمی است. برای اجرای عملیاتی و تولید تجاری، لازم است تحت نظارت متخصصان مجرب کشت بافت و با انجام آزمایش‌ های مقدماتی بهینه‌سازی گردد.

“مرجع کشت بافت گیاهی ایران برای مطالعه جدیدترین مقالات “

منابع

1. Zaid, A., El-Korchi, B., & Visser, H. J. (2011). Commercial Date Palm Tissue Culture Procedures and Facility Establishment. Date Palm Biotechnology, 137–۱۸۰. doi:10.1007/978-94-007-1318-5_8
2. https://www.britannica.com/plant/date-palm
3. https://en.wikipedia.org/wiki/Date_palm

تاریخ به روز رسانی: ۱۹ بهمن ۱۴۰۴