کشت سوسپانسیون

کشت سوسپانسیون در کشت بافت گیاهی

کشت سوسپانسیون سلول گیاهی یک کشت مایع است که در آن سلول‌های کالوس نرم یا شکننده، تقسیم و تکثیر می‌شوند. از این نوع کشت برای به دست آوردن متابولیت های ثانویه در داروسازی، آرایشی و بهداشتی یا در صنایع غذایی استفاده می شود. در این روش، سلول ها در محیط کشت غوطه ور هستند.

سلول های گیاهی توانایی این را دارند که هر کدام به یک گیاه کامل تبدیل شوند. این قابلیت سلول های گیاهی (Totipotency) نام دارد. به همین دلیل، تک تک سلول های گیاهی پتانسیل تبدیل شدن به گیاهان کامل را دارند. در کشت بافت گیاهی ما از تمام توان سلول های گیاهی با استفاده از تکنیک های مختلف بهره برداری می کنیم. بنابراین، این امکان وجود دارد که نه تنها با استفاده از بافت‌های مریستمی، جنینی و بالغ یک گونه گیاهی، بلکه با استفاده از سلول‌های منفرد نیز اقدام به کشت سلولی کرد.

 

 

کشت سوسپانسیون سلولی چیست؟

کشت سوسپانسیون سلولی، تکثیر سلول های منفرد با سرعت بالاتر در یک محیط مایع است. محیط مایع به طور مداوم بر روی یک تکان دهنده مداری (Shaker) به هم زده می شود. این روش کشت توسط دانشمندان برای مطالعه رشد و تکامل سلولی استفاده می شود. همچنین یک روش کشت بافت رایج برای بسیاری از صنایع به منظور استخراج ترکیبات خاصی از سلول های گیاهی است.

تکانه های شیکر سبب می شود تا سلول ها تبادلات گازی کارآمدتری داشته باشند. هم زدن محیط همچنین فشار ملایمی بر بافت وارد می کند و آن را به قطعات سلولی کوچکتر و تک سلولی می شکند. این هم زدن به حفظ توزیع و حرکت یکنواخت سلول ها در محیط کمک می کند.  برای ایجاد کشت سوسپانسیون سلولی ابتدا به سلول های تک گیاهی نیاز داریم. می توان از قطعات کالوس‌های متمایز نشده و شکننده کالوس استفاده کرد.

کالوس Callus

کالوس توده‌ای نامنظم از بافت‌های گیاهی است که ساختاری ندارد، اما توانایی تمایز به اندام‌های مختلف گیاهی را دارد (توده تمایز نیافته از سلول های گیاهی). می توان کالوس های مختلفی را از یک ریزنمونه به دست آورد. با این حال، کالوس ها از یک ریزنمونه ممکن است دارای تنوع در رنگ، بافت و غیره باشند. برای روش سوسپانسیون سلولی به کالوس های نرم و شکننده نیاز داریم. یکی از حقایق جالب در مورد کشت کالوس این است که می توانید آنها را برای مدت نامحدودی بدون هیچ تمایز خاصی تکثیر کرد.

 

انواع کشت سوسپانسیون سلولی

به طور کلی، دو نوع کشت سوسپانسیون سلولی دارد:

کشت های دسته ای (Batch cultures)

این یک کشت سیستم بسته است که به موجب آن می‌توانیم سلول‌ها را در مقدار ثابتی از محیط کشت تحت شرایط مناسب رشد دهیم. این نوع سوسپانسیون سلولی با استفاده از فلاسک های تا حجم ۲۵۰ میلی لیتر انجام می شود. می توان اولین فلاسک را با سلول ها به عنوان تلقیح برای فلاسک های بعدی در حالت تعلیق قرار داد. برای هر کشت بعدی، مقدار کمی از سوسپانسیون اولیه گرفته می شود و سپس به محیط تازه منتقل می شود.

یکی از اشکالات عمده کشت های دسته ای این است که سلول ها تا یک نقطه خاص رشد می کنند و سپس رشد سلولی ثابت می شود. در این فاز ثابت، تعداد سلول ها و اندازه سلول ها ثابت می ماند. سلول ها یا به دلیل فرسودگی برخی عوامل رشد یا تجمع متابولیت های سمی در محیط کشت به فاز ساکن می رسند. با این حال، می توان با استفاده از محیط کشت تازه با سرعت بیشتر از این مرحله اجتناب کنید.

کشت های مستمر (Continuous cultures)

در این نوع کشت سوسپانسیون سلولی، می توان فاز رشد سلولی را ثابت نگه داشت. در اینجا محیط تازه باید به طور مداوم اضافه شده و مواد مغذی باقیمانده و محصولات نهایی متابولیک به طور مداوم از محیط حذف شوند. بنابراین، با استفاده از این روش می توان از مشکل سم زدایی محیط های کشت جلوگیری کرده و اشکال کشت های دسته ای را بر طرف کرد.

دو نوع کشت مستمر یا پیوسته وجود دارد:

کموستات (Chemostat)

در این روش می توانید محیط تازه را در حین برداشت به همان میزان از کشت اضافه کنید. این باعث حفظ رشد سلولی ثابت می شود. با این حال، باید غلظت یکی از مواد مغذی، نیتروژن، فسفر و گلوکز را تنظیم کنید تا عامل محدودکننده رشد باشد.

توربیدوستات (Turbidostat)

در این روش زیست توده سلول ها به طور مداوم در سطح زیر حداکثر بازده حفظ می شود. برخلاف یک عامل محدود کننده در کشت کموستات، می توانید تمام مواد مغذی را بیش از حد فراهم کنید. با مشاهده کدورت/ضخامت کشت می توانید افزودن محیط تازه را کنترل کنید.

چگونه می توان رشد سلول ها را در کشت سوسپانسیون تعیین کرد؟

دانشمندان می توانند رشد سلول ها را در کشت سوسپانسیون با استفاده از ابزارهایی مانند هموسیتومتر، قیف هارتلی و غیره در آزمایشگاه تعیین کنند. به زبان ساده در آزمایشگاه کشت بافت: تعداد سلول ها در کشت، حجم سلول بسته بندی شده، وزن تازه سلول ها در کشت و وزن خشک سلول ها در کشت اندازه گیری می شود.

بر اساس مقادیر به‌دست‌آمده از این اندازه‌گیری‌ها، تغییرات در ترکیب محیط و همچنین میزان هم زدن، تعیین می‌شود.

 

 

روش های ارزیابی زنده ماندن سلول ها در کشت سوسپانسیون

برای انجام این نوع ارزیابی به آزمایشگاهی با ابزارهایی مانند میکروسکوپ و ترکیبات شیمیایی خاص مانند نمک تترازولیوم، رنگ ‌های رنگ‌آمیزی و غیره نیاز داریم. روش‌های مختلف برای ارزیابی زنده‌مانی سلول‌ها وجود دارد که مهمترین آنها عبارتند از:

• میکروسکوپ فاز کنتراست (Phase-contrast microscopy): در اینجا با مشاهده اجزای سلولی سالم و حرکات درون سلولی که از سوسپانسیون سلولی به دست می‌آید، زنده مانی سلول ها ارزیابی می شود.
• کاهش نمک تترازولیوم (Tetrazolium salt reduction): با این روش می توان کارایی تنفسی سلول ها را اندازه گیری کنند.
• روش فلورسئین دی استات (FDA): با استفاده از این روش می توان درصد زنده ماندن سلول ها را اندازه گیری کرد. روش فلورسئین دی استات بر اساس اصل روشنایی سلول به رنگ سبز فلورسنت کار می کند.
• لکه گذاری آبی ایوان (Evan’s blue staining): طی این سلول ها را با رنگ آبی ایوان درمان می کنند که در آن سلول های مرده رنگ را می گیرند و سلول های زنده بدون رنگ باقی می مانند.

سوسپانسیون های سلولی برای مطالعه رفتار یک متابولیت یا پروتئین معین در یک محیط مایع یا برای تولید انبوه متابولیت ها استفاده می شوند. برخی از کاربردهای مهم کشت سوسپانسیون عبارتند از :

• تولید پروتئین درمانی توسط سلول های CHO
• تولید متابولیت ثانویه برای داروها در سلول های گیاهی
• تولید پروتئین نوترکیب در سلول های حشرات
• تولید پروتئین حجیم برای تحقیقات آنزیمی و واکسن

 

منابع

• Interpreting SFR vario Online Data Gathered in Plant Cell Suspension Cuselture | Presens
• Role of plant tissue culture medium components | Research Gate
•  Cuperus, F. S.: Influence of UV-B radiation on quality determing compounds in must and wine and suspension cell cultures of Vitis vinifera, ETH Zürich,phdthesis, 2007. http://dx.doi.org/10.3929/ethz-a-005347787. – DOI 10.3929/ethz–a–۰۰۵۳۴۷۷۸۷