اصول‎ PCR ‎

اصول PCR

اصول PCR

مقدمه و تاریخچه

در گذشته برای تولید قطعات نوکلئوتیدی معمولا از روش های شیمیایی استفاده می‌کردند و یا برای بدست آوردن نسخه های متعدد از یک ژن خاص، این ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیر می نمودند. این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند. تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reacti ) به منظور تکثیر یک قطعه DNA در سال ۱۹۸۴ توسط کری مولیس (Kary Mullis) کارمند شرکت Cetus ارائه شده است.

PCR  مزایای بسیاری داشت (از جمله بررسی یک روزه نمونه ها، ارزان بودن نسبی، آسانی انجام و فوق العاده اختصاصی بودن) و انقلابی در تشخیص کلینیکی بیماری ها، پزشکی، علوم جنایی و پلیسی، میکروبیولوژی و بسیاری صنایع ایجاد کرد. این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را برطرف کرد و امروزه تقریباً در تمامی آزمایشگاههای زیست مولکولی جزو کارهای متداول بوده و به صورت اتوماتیک بوسیله ی کامپیوتر انجام می شود. به دلیل همین کشف در سال ۱۹۹۳، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.

PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود. با این روش می توان یک ژن را به اندازه ای تکثیر کرد تا بتوان با استفاده از روش‌هایی مانند الکتروفورز مشاهده کرد. شما یک تار مو را از فاصله ۶ متری نمی توانید ببینید اما یک دسته میلیاردی از مو کنار هم به خوبی مشاهده می شوند.

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA  پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase  به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها استفاده می شود. در این تکنیک ابتدا پرایمراز DNA  موردنظر، طراحی می شود و بعدا با استفاده ازPCR ، هدف را تکثیر کرده و توسط الکتروفورز در مقابل یک کنترل می سنجند.

 

مواد لازم برای PCR

• DNA الگو (Template  DNA)
• دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTPs)
• پرایمرهایForward و Reverse 
• Taq DNA polymerase
• بافر
• کاتیون های دو ظرفیتی(یون های منیزیم یا منگنز) و کاتیون های یک ظرفیتی (یون پتاسیم) 

 

 

مراحل  PCR

۱- مرحله واسرشت (Denaturation step)

این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد. هرچه زمان Ramp (زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد) کمتر باشد نتیجه کار بهتر است و واکنش، زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار می گیرد. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد.

۲- مرحله اتصال (Annealing step) 

دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به ۳۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این دما دو رشته هر مولکول میتوانند دوباره به یکدیگر متصل شوند ولی این اتفاق نمی افتد زیرا مخلوط حاوی مقدار بیشتری مولکول های کوچک DNA به نام پرایمر(Primer) است که معمولا از ۲۵-۱۸ باز آلی تشکیل شده اند و به DNAی تک رشته ای الگو متصل می شوند. دمای اتصال در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است.

PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA بر اساس قوانین معروف واتسون- کریک دارد و در واقع برگرفته از آن است. همیشه A با T و G با C جفت می شود. بنابراین پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند و رشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.

۳- مرحله پلیمریزاسیون یا طویل شدن (Extension/elongation step)

آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر- الگو، با اضافه کردن نـوکـلـئـوتـیـد تـری فـسـفـات‌هـای موجود در محلول بر روی عامل-OH  َ۳ پرایمرها همانند سازی DNA را آغاز کرده و رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد. دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب می شود.

مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز، تعداد بازهای بین دوپرایمر و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود.

۴- ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از این ۳ مرحله، چرخه اول تمام می‌شود و چـرخـه ‌های بعدی تکرار چرخه اول است. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد. بار دیگر سیستم گرم می شود و در اینجا هشت نسخه بوجود می آید، و در مرحله ی بعد ۱۶ نسخه و به همین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدی و به نسبتⁿ۲ افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. به طور مثال یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر می شود.

تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب می شود. لازم به ذکر است که DNA های کوتاه (Short target product) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential) و DNA های بلند (long target product) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود می باشند بصورت تصاعد حسابی (linearly) زیاد می شوند.

۵- مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation)

این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند. دمای لوله ها و فواصل زمانی تابع عوامل مختلفی از جمله نقطه ذوب پرایمرها (T_m)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها است.

۶- نگهداری نهایی (Final hold)

در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

۷- ردیابی (detect) محصول PCR

نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)، الکتروفورز نمودن همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) و یا رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید بررسی نمود.

یادگیری صحیح و دقیق اصول PCR به درک بهتر فرآیندهای همانندسازی کمک زیادی می کند. بسیاری از اتفاقات و تغییر و تحولات طی آزمایش در PCR رخ می دهد، به همین دلیل در بسیاری از موارد توقعی که از مشاهده باندها در الکتروفورز داشتیم برآورده نمی شود.