کشت بافت گردو

پروتکل جامع تولید نهال گردو به روش کشت بافت

کشت بافت گردو یکی از روش‌های پیشرفته در تکثیر این درخت ارزشمند است. این روش به ویژه در تولید گیاهانی با کیفیت بالا و عاری از بیماری اهمیت زیادی دارد. گردو یکی از محصولات باغی با ارزش اقتصادی بالا است که تکثیر آن از طریق کشت بافت می‌تواند به افزایش تولید و بهبود کیفیت نهال‌ ها کمک کند. در این مقاله، روش و پروتکل کشت بافت گردو به طور جامع بررسی خواهد شد.

 

 

انتخاب و آماده‌سازی ریز نمونه ‌ها

برای شروع کشت بافت گردو، ریز نمونه‌های مناسب از بافت ‌های گردو شامل جوانه‌های انتهایی یا جانبی انتخاب می‌شوند. این نمونه‌ها باید از گیاهان سالم و عاری از بیماری انتخاب شوند. ریز نمونه ها باید از درختان مادری سالم، شاداب و عاری از هر نوع آلودگی انتخاب شوند.

ویژگی‌های جوانه ‌های مناسب

جوانه‌های انتهایی یا جانبی که به تازگی تشکیل شده‌اند و رشد فعال دارند.

جوانه‌هایی که عاری از هرگونه آسیب یا علائم بیماری هستند.

جوانه‌هایی که از گیاهان مادر سالم و قوی گرفته شده‌اند.

 

 

ضد عفونی ریزنمونه ها (جوانه ها)

جوانه‌ها باید به دقت ضدعفونی شوند تا از هرگونه آلودگی قارچی و باکتریایی جلوگیری شود.

مراحل ضدعفونی

جوانه‌ها را ابتدا با آب جاری شستشو دهید تا خاک و ذرات بزرگتر حذف شوند. سپس ریزنمونه ها را به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم ۵% قرار دهید. برای افزایش کارایی می‌توان چند قطره مایع توین ۲۰ به محلول اضافه کرد. پس از ضدعفونی، جوانه‌ها را سه تا پنج بار با آب استریل شستشو دهید تا باقی‌مانده محلول ضدعفونی‌کننده کاملاً حذف شود. در صورتی که پس از انجام این مراحل باز هم آلودگی مشاهده شد می توان از ترکیبات زیر استفاده کرد:

اتانول (الکل ۷۰%)

این ماده یک ضدعفونی‌کننده مؤثر برای کشت بافت است که به سرعت میکروارگانیسم‌ها را از بین می‌برد.

روش استفاده:

غلظت: ۷۰%

زمان: ۳۰ ثانیه تا ۱ دقیقه

پس از ضدعفونی با اتانول، نمونه‌ها باید بلافاصله با آب استریل شستشو داده شوند تا اثرات باقی‌مانده اتانول حذف شود.

کلرید جیوه (مرکوری کلرید)

کلرید جیوه یکی از ضدعفونی‌کننده‌های قوی است، اما به دلیل سمی بودن آن باید با احتیاط استفاده شود. از آنجایی که این محلول بسیار قوی  است و در صورت استفاده نادرست می تواند ریز نمونه ها از بین ببرد، بهتر است از غلظت ۰.۰۱ درصد شروع به استفاده کرد.

روش استفاده:

غلظت: ۰.۰۱-۰.۲%

زمان: ۲-۱۰ دقیقه

پس از ضدعفونی با کلرید جیوه، نمونه‌ها باید حداقل سه بار با آب استریل شستشو داده شوند تا باقی ‌مانده‌های سمی حذف شوند.

 

 

 پرکلرین (کلرین دی‌اکسید)

پرکلرین یک ماده ضدعفونی‌کننده قوی با خواص قارچ‌کشی و باکتری‌کشی است.

روش استفاده:

غلظت: ۰.۵-۱%

زمان: ۱۰-۱۵ دقیقه

پس از ضدعفونی با پرکلرین، نمونه‌ها باید با آب استریل شستشو داده شوند.

پراکسید هیدروژن (H₂O₂)

پراکسید هیدروژن یک ضدعفونی‌کننده موثر و امن‌تر نسبت به کلرید جیوه است.

روش استفاده:

غلظت: ۳-۶%

زمان: ۵-۱۰ دقیقه

پس از ضدعفونی با پراکسید هیدروژن، نمونه‌ها باید با آب استریل شستشو داده شوند.

 کلرید کلسیم (Ca(ClO)₂)

کلرید کلسیم به عنوان یک ضدعفونی‌کننده موثر برای گیاهان استفاده می‌شود.

روش استفاده

غلظت: ۱-۲%

زمان: ۱۰-۱۵ دقیقه

پس از ضدعفونی با کلرید کلسیم، نمونه‌ها باید با آب استریل شستشو داده شوند.

ترکیب و روش ضدعفونی ترکیبی در کشت بافت گردو

در بسیاری از موارد، از ترکیب چند ضدعفونی‌کننده برای بهبود کارایی ضدعفونی استفاده می‌شود. به عنوان مثال:

غوطه‌ور کردن نمونه‌ها در اتانول ۷۰% به مدت ۳۰ ثانیه.

انتقال نمونه‌ها به محلول هیپوکلریت سدیم ۵% به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه.

شستشو با آب استریل به مدت ۳-۵ دقیقه.

استفاده از پراکسید هیدروژن ۳% به مدت ۵ دقیقه.

شستشوی نهایی با آب استریل.

ترکیب و تهیه محیط کشت برای کشت بافت گردو

برای کشت بافت گردو، از محیط کشت MS (Murashige and Skoog) استفاده می‌شود که با مواد مغذی و هورمون‌های گیاهی بهینه‌سازی می‌شود. همچنین در مواردی بسته به نوع ریزنمونه می نوانید از محیط کشت WPM نیز استفاده کنید. در ادامه، ترکیب و مقادیر مواد مورد نیاز برای تهیه محیط کشت آورده شده است.

مواد معدنی پایه محیط MS

ترکیبات اصلی

ویتامین ها

کربوهیدرات منبع انرژی

هورمون های گیاهی

هورمون های القای جوانه زنی

هورمون های القای ریشه زایی

هورمون های خانواده اکسین، مهمترین و کاربردی ترین هورمون گیاهی برای القای ریشه زایی در کشت بافت گیاهی است.

ایندول-۳-بوتیریک‌اسید (IBA)

۰.۵-۱ mg/l

آگار برای کشت بافت گردو

آگار یک ماده ژله کننده محیط کشت است. مقدار مورد استفاده در محیط کشت گردو حدود ۷ الی ۸ گرم برای هر لیتر است. pH محیط کشت باید در محدوده ۵.۷-۵.۸ تنظیم شود. برای تنظیم میزان اسیدیته محیط کشت باید از HCl یا NaOH استفاده کنید.

برش و تلقیح جوانه‌ها

۱. برش جوانه‌ها

برش جوانه‌ ها باید در شرایط استریل در زیر هود لامینار ایرفلو انجام تا از  ایجاد آلودگی خصوصا آلودگی های قارچی جلوگیری شود.

مراحل برش:

• از ابزارهای استریل مانند پنس و اسکالپل استریل استفاده کنید. دقت شود حتما از چند جفت پنس و اسکالپل استفاده شود تا پس از هر برش یک جفت داخل دستگاه استریل حرارتی قرار گیرند.
• جوانه‌ها را به اندازه‌های کوچک، معمولاً ۱-۲ سانتیمتر، برش دهید.
• برش‌ها باید شامل قسمت‌ های انتهایی و جانبی جوانه باشند.

۲. قرار دادن جوانه‌ها در محیط کشت

ریز نمونه های بریده شده به دقت در محیط کشت قرار داده می‌شوند. محیط کشت باید قبلاً آماده و توسط اتوکلاو استریل شده باشد. پس از خروج ظروف محیط کشت از اتوکلاو، باید اجازه دهید تا محیط ها کاملا سرد و ژله شود.

مراحل تلقیح:

• ظروف کشت (پتری دیش یا لوله‌های کشت) حاوی محیط کشت استریل آماده کنید.
• جوانه‌های بریده شده را با استفاده از پنس استریل در محیط کشت قرار دهید. باید توجه داشته باشید که جوانه‌ها به طور کامل با محیط کشت تماس داشته باشند.
• ظروف کشت را به سرعت با درپوش‌های استریل ببندید تا از آلودگی جلوگیری شود.

نگهداری و شرایط رشد

۱. شرایط دما و نور

ظروف کشت باید در شرایط مناسب دما و نور قرار داده شوند.

شرایط مطلوب:

• دمای ۲۵-۲۷ درجه سانتی‌گراد
• نور با فتوپریود ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی

 

 

۲. بررسی و انتقال

جوانه‌ها باید به طور منظم بررسی شوند تا از رشد مناسب و عدم آلودگی اطمینان حاصل شود.

مراحل بررسی:

• هر هفته ظروف کشت را بررسی کنید.
• در صورت مشاهده هرگونه آلودگی، ظرف‌های آلوده را به سرعت از بقیه جدا کنید.
• پس از چند هفته، جوانه‌ها شروع به رشد خواهند کرد. زمانی که ریزنمونه ها به اندازه کافی بزرگ شدند باید در صورت نیاز واکشت (Subculture) شده و در محیط کشت جدید قرار بگیرند. ریزنمونه هایی که شرایط لازم را دارند به محیط کشت حاوی هورمون‌های ریشه‌زایی (مانند IBA) منتقل شده تا فرآیند ریشه‌زایی را طی کنند.

جمع بندی

انتخاب، برش و تلقیح جوانه‌ها در کشت بافت گردو نیاز به دقت و شرایط استریل دارد. با رعایت دقیق این مراحل، می‌توان به نتایج مطلوب در تولید نهال‌های گردو از طریق کشت بافت دست یافت. این روش نه تنها کارآمد است بلکه به بهبود کیفیت و سلامت نهال‌ ها نیز کمک می‌کند. واریته های مختلف گردو امکان تولید از طریق کشت بافت را دارند، در حال حاضر ارقام گردو چندلر، فرنور، فرانکت، هاوارد و رند بیشترین اقبال تجاری را برای تولید به روش کشت بافت در سراسر جهان دارند. Juglans regia که با نام گردوی ایرانی نیز شناخته می شود از پر طرفدارترین ارقام گردو در جهان است.

کشت بافت گیاهی یک روش مؤثر و کارآمد برای تکثیر گردو است که به بهبود کیفیت و افزایش تولید کمک می‌کند. این روش نیاز به تجهیزات و شرایط استریل دارد، اما با توجه به نتایج مثبت آن، می‌تواند به عنوان یک راهکار پایدار برای تولید نهال‌های گردو مورد استفاده قرار گیرد.

منابع

1. López Martínez, J. M. (2004). Walnut Tissue Culture: Research and Field Applications. In: Michler, C. H., Pijut, P. M., Van Sambeek, J. W., Coggeshall, M. V., Seifert, J. R., Woeste, K., & Overton, R. P. (Eds.), Black Walnut in a New Century: Proceedings of the 6th Walnut Council Research Symposium (pp. 146-151). U.S. Department of Agriculture, Forest Service, North Central Research Station. Available at: https://www.fs.usda.gov/research/treesearch/14724
3. Revilla, M. A., & Barredo, Y. (1990). Micropropagation of walnut (Juglans regia L.) by nodal cutting. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, ۲۱(۱), ۱-۶. doi:10.1007/BF00034423
4. Corredoira, E., Ballester, A., & Vieitez, A. M. (2008). Thidiazuron-induced high-frequency shoot organogenesis in cultures of Juglans regia L. Plant Cell Reports, ۲۷(۵), ۷۱۱-۷۱۸. doi:10.1007/s00299-008-0505-3
5. Espinosa, A. C., Guerra, D., & Rangel, C. (2006). In vitro propagation of walnut (Juglans regia L.) through axillary shoot proliferation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, ۸۵(۲), ۲۳۱-۲۳۵. doi:10.1007/s11240-005-9073-1
6. Rodriguez, R., Canhoto, J. M., & Graca, J. (1989). Micropropagation of Juglans regia L. from nodal segments of mature trees. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, ۱۹(۲), ۱۵۹-۱۶۸. doi:10.1007/BF00034423
7. Tang, H. R., & Guo, D. P. (2001). Micropropagation of walnut (Juglans regia L.) through in vitro shoot multiplication. Plant Cell Reports, ۲۰(۷), ۴۹۶-۵۰۲. doi:10.1007/s002990100365
8. Martínez, M. T., Corredoira, E., & Vieitez, A. M. (2010). Clonal propagation of hybrid walnut trees (Juglans nigra x Juglans regia) by somatic embryogenesis. Tree Physiology, ۳۰(۳), ۴۰۰-۴۱۳. doi:10.1093/treephys/tpq003

9. Al-Khayri, J. M., Jain, S. M., & Johnson, D. V. (Eds.). (2015). Walnut (Juglans spp.) Biotechnology. In: Advances in Plant Breeding Strategies: Breeding, Biotechnology and Molecular Tools (pp. 497-516). Springer International Publishing. doi:10.1007/978-3-319-22518-0_17