تست الایزا ELISA

تست الایزا ELISA

تست الایزا  ELISA یا تست الیزا یک روش بیوشیمی تحلیلی است که برای اولین بار در سال ۱۹۷۱ توسط Engvall و Perlmann معرفی شد. این روش با استفاده از یک نوع فاز جامد از روش عیار سنجی ایمنی یا به اصلاح انگلیسی immunoassay (EIA) برای تشخیص وجود لیگاند (معمولاً یک پروتئین) در یک نمونه مایع با استفاده از آنتی بادی های ضد پروتئین برای اندازه گیری استفاده می شود. بطور خلاصه الایزا یک ابزار تشخیصی است که در بیوتکنولوژی، گیاهپزشکی (تشخیص بیماری های ویروسی در گیاهان) و همچنین به عنوان ابزاری برای بررسی و کنترل کیفیت در صنایع مختلف استفاده می شود.

 

در تست الایزا، ویروس بیماری زا مورد جستجو قرار نمی گیرد، بلکه پایه تشخیص و ردیابی از طریق وجود مقادیر آنتی بادی (پادتن) مربوط به آن ویروس انجام می شود. روش تشخیص الایزا در گروه تکنیک های تشخیص آزمایشگاهی مرطوب یا تر ) Wet Lab) قرار می گیرد.

در موارد حساس برای جلوگیری از بروز هر گونه خطا، پس از تست الایزا از روش وسترن بلاتینگ Western Blotting نیز برای تایید نتیجه الایزا استفاده می شود.

.

تست الایزا چگونه کار می کند؟

در ساده ترین فرم الایزا، آنتی ژن های نمونه مورد آزمایش، به یک سطح که عموما پلاستیکی است متصل شده و سپس یک آنتی بادی (کاملا منطبق) به منظور اتصال به آن آنتی ژن در سطح اعمال می شود. در مرحله بعدی این آنتی بادی ها به یک آنزیم متصل می شوند و سایر آنتی بادی هایی که در سطح به آنزیمی متصل نیستند از بین می روند.

در آخرین مرحله ماده ای حاوی بستر آنزیم اضافه به سطح اضافه می شود، در این حالت اگر اتصال مثبتی تشخیص داده شود، نتیجه بوسیله یک سیگنال قابل تشخیص که معمولا تغییر رنگ است، نشان داده می شود. در صورتی که آنتی بادی اضافه شده قادر به اتصال نباشد، واکنش منفی است و تغییر رنگی ایجاد نمی شود.

 

 

به زبان ساده نمونه مورد آزمایش در ابتدا سانتریفیوژ دور بالا شده تا محتویات ماده از هم جدا شوند، سپس با توجه به ویروسی که به دنبال شناسایی آن هستیم، یک ماده معرف به آن اضافه می شود که در صورت وجود آنتی بادی های مربوط به آن ویروس خاص، اتصال برقرار شده و بستر با تغییر رنگ وجود ویروس در ماده آزمایشی را اعلام می کند.

.

میکروپلیت

میکرو پلیت های پلی استری، سطح پلاستیکی است که برای بی حرکت کردن آنتی ژن های نمونه مورد آزمایش استفاده می شود. پس از آنکه آنتی ژن ها بی حرکت شدند به همراه آنتی بادی های تشخیص اضافه شده، تشکیل یک کمپلکس را می دهند. آنتی بادی تشخیصی می تواند بوسیله پیوند کووالانسی به آنزیم متصل شود و یا اینکه توسط یک آنتی بادی ثانویه که از طریق بیو پیوند به یک آنزیم متصل است ، شناسایی شود.

بین هر مرحله ، میکروپلیت ها به طور معمول با یک محلول شوینده ملایم شستشو داده می شود تا پروتئین ها یا آنتی بادی هایی که به طور غیر اختصاصی اتصالی ندارند از سطح پلیت حذف شوند. پس از اینکه مرحله شستشو به پایان رسید ، یک بستر آنزیمی به منظور ایجاد سیگنال اتصال مثبت که نشان دهنده مقدار آنتی ژن موجود در نمونه مورد آزمایش است به میکروپلیت اضافه می شود.

.

انواع آزمون الایزا

الایزا به روش های مختلفی به شرح ذیل انجام می شود

• الایزا مستقیم (Direct Elisa): الایزا مستقیم ساده ترین روش بوده و برای شناسایی آنتی ژن ها با وزن مولکولی بالا مناسب است. در این روش از آنتی بادی ثانویه استفاده نشده و مراحل کار کوتاهتر است. از آنجایی که در این روش باید آنتی بادی اولیه را نشان دار کرد، دارای هزینه بالایی است و به ندرت مورد استفاده قرار می گیرد.
• الایزا غیر مستقیم (Indirect Elisa): در این روش از آنتی بادی ثانویه نشان دار شده استفاده می شود. این روش نسبت به روش مستقیم پرکاربردتر است زیرا می توان گستره وسیع تری از آنتی بادی ها را استفاده کرد و دارای حساسیت بالاتری نیز می باشد.
• الایزا ساندویچ (Sandwich Elisa) : این روش نیز حساسیت و انعطاف پذیری بالایی دارد و از مزایای مهم آن این است که نمونه قبل از آزمایش، نیازی به خالص سازی ندارد. همچنین اتصال آنتی ژن و آنتی بادی ها کاملا اختصاصی انجام می شود.
• الایزا رقابتی Competitive ELISA : این روش که با نام الایزا بازدارنده Inhibition ELISA نیز شناخته می شود. همان طور که از نام این روش پیداست، دو آنتی ژن برای اتصال به آنتی بادی با یکدیگر رقابت می کنند که با استفاده از این روش غلظت آنتی ژن اندازه گیری می شود.

 

.

تست الایزا ELISA در کشاورزی

در حال حاضر این تست بطور گسترده برای تشخیص بیماری های ویروسی گیاهان و محصولات مهم زراعی و باغی استفاده می شود، در ایران نیز سال ها است که این نوع تست تشخیصی، مرجعی برای صدور لیبل و گواهی نهال های تولید شده می باشد.

.

کیت های تشخیص ویروسی الایزا

در حال حاضر کیت های الایزا به منظور تشخیص بیماری های ویروسی گیاهان تولید و عرضه می شود، برخی از مهمترین این کیت ها به شرح ذیل هستند:

• ویروس موزائیک یونجه Alfalfa Mosaic Alfamovirus. AMV
• ویروس لکه برگی کلروتیک سیب Apple Chlorotic Leafspot Trichovirus. ACLSV
• ویروس پنهان سیب زمینی Andean Potato Latent Tymovirus
• ویروس موزائیک سیب Apple Mosaic Virus (ApMv)
• ویروس موزائیک آرابیس Arabis Mosaic Virus (ArMV)
• ویروس موزائیک سبز خیار Cucumber Green Mottle Mosaic
• و …………….