راهنمای دستورالعمل و پروتکل کشت بافت موز

دستور العمل کشت بافت و ریزازدیادی درخت موز

کشت بافت و ریزازدیادی، رشد بافت ها یا سلول های جدا از گیاه مادری است. کشت گیاهچه ها از طریق استفاده از یک محیط رشد مایع، نیمه جامد یا جامد در شرایط آزمایشگاهی و کاملا استریل انجام می شود. گیاه موز معمولاً به صورت رویشی تکثیر می شود. بنابراین کشت بافت به عنوان یک تکنیک تکثیر سریع و با دقت بالا ابزاری کارآمد برای تهیه گیاهچه ها (نهال ها) عاری از بیماری و آلودگی است که می تواند اولین خط دفاعی را در توسعه یک برنامه مدیریت یکپارچه مبارزه با آفات و بیماری ها برای موز فراهم کند. کشت بافت موز بهترین روش شناخته شده برای تولید نهال موز است.

.

.

مراحل کشت بافت و ریزازدیادی موز

تکنیک‌های کشت بافت استفاده شده برای موز شامل کشت ساقه و مریستم، کشت کالوس، جنین‌زایی سوماتیکی، سوسپانسیون سلولی و کشت پروتوپلاست است.

.

جمع آوری مواد گیاهی

می توان از پاجوش ها و نهال های با ارتفاع حدود ۴۰ تا ۱۰۰ سانتی متر (۱ متر) به عنوان ماده گیاهی (درخت مادری) برای تکثیر استفاده کرد. لازم است ابتدا برگ هایی از این پاجوش ها برای تست بیماری BBTV به آزمایشگاه های گیاهپزشکی منتقل شده تا از عاری بودن به این بیماری ویروسی اطمینان حاصل کرد. حتما دقت شود پاجوش هایی که اندازه کوچکتری دارند، ضعیف تر بوده و به دلیل عدم تکامل سیستم ریشه ای، احتمال تلف شدن پس از جدا سازی از درخت مادری بسیار بالا است.

پاجوش مورد نظر باید با دقت جداسازی شده بطوری که به ساقه کاذب هیچ آسیبی وارد نشود. (برخی از منابع گزارش کرده اند بهتر است ساقه کاذب با زاویه ۳۰ درجه جداسازی شود). در مرحله بعدی، مریستم ساقه کاذب (مغز داخل ساقه) به قطعه ای به طول ۱۰ سانتی متر از پاجوش جدا می شود.

.

ضد عفونی ریز نمونه (Disinfection)

ریز نمونه جمع آوری شده از مزرعه را با آب جاری بشویید تا خاک چسبیده پاک شود. سپس ریزنمونه  جدا شده را به مدت ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در یک هیپوکلرید سدیم (۵.۲۵٪ NaOCl) غوطه ور کنید. پس از گذشت این مدت، ریزنمونه را خارج کرده و با آب مقطر سه بار شستشو می دهیم. ( غلظت استریل کننده، مدت زمان استریل، استفاده از قارچ کش ها یا سایر مواد ضدعفونی مانند تویین ۲۰، بستگی به شدت آلودگی و عرصه جمع آوری ریز نمونه ها دارد.)

.

آماده سازی محیط کشت (Media Preparation)

برای کشت بافت خرما می توان از محیط MS استفاده کرد، برای تهیه محیط کشت MS می توان از دستورالعمل زیر استفاده کرد:

 

 

تلقیح (Inoculation)

پس از آماده سازی محیط کشت، آن را در شیشه های (Jar) مخصوص، توزیع کرده و همراه با اسکالپل، پنس، صفحات برش به داخل اتوکلاو منتقل می کنیم. پس از پایان اتوکلاو و اطمینان از انجام شدن صحیح و کامل روند ضدعفونی، شیشه های حاوی محیط کشت، همراه با ریزنمونه های استریل شده را به زیر جریان هود لامینار ایرفلو منتقل می کنیم.

.

 

.

در این مرحله پوشش بیرونی ریزنمونه که با مواد ضدعفونی در تماس بوده است برش داده تا غلاف بیرونی بطور کامل از مریستم جدا شود. با استفاده از اسکالپل برش مغز داخل ساقه را ادامه داده تا در نهایت بافتی با ابعاد ۱ × ۱ باقی بماند. هنگام برش باید بسیار دقت شود تا آسیب جدی به مریستم وارد نشود. ریزنمونه به دست آمده را در یک پطری دیش استریل قرار داده و به صورت طولی و از مرکز به چهار قسمت برش داده می شود. سپس هر قسمت در روی یک محیط کشت قرار می گیرد.

.

اتاق رشد (Growth Room)

شیشه های حاوی ریزنمونه موز برای نگهداری به اتاق رشد با فتوپریود ۱۶ ساعت روشنایی منتقل می شوند. اتاق رشد باید دارای تهویه مناسب و نور کافی بوده (۴۰-watt fluorescent ) باشد. به محض مشاهده کوچکترین آلودگی، باید شیشه های آلوده را از اتاق رشد خارج کرد. در طی دوره رشد، ریزنمونه ها باید به دقت زیر نظر گرفته شود تا هرگونه، قهوه ای شدن، سبز شدن بافت برگ، شاخه زایی و تورم، مشاهده شود.

زمانی که نوک شاخه های تازه رشد کرده به اندازه ۲ سانتی متر ارتفاع گرفتند، نشان دهنده زمان مناسب برای واکشت (Subculture) است.

.

.

واکشت (Subculture)

همان طور که پیش تر گفته شد، هر زمان که شاخه ها حدود ۲ سانتی متر ارتفاع داشتند، نوک شاخه یا بخش های شاخساره را باید به محیط کشت تازه در شرایط آزمایشگاهی منتقل کرد. شاخه هایی بیش از حد رشد کرده باشند، امکان تکثیر آن ها کمتر است. اگر اندازه ساقه‌ها بیشتر از ۲ سانتی‌متر است، باید یک برش طولی از راس شاخه در حال رشد ایجاد شود.

.

 

محیط کشت MS  حاوی ۵ میلی گرم در لیتر هورمون BAP برای واکشت مناسب است. ( انتخاب محیط کشت برای واکشت های مجدد و انتخاب هورمون ها و غلظت آن ها به شرایط ریزنمونه نیز بستگی دارد). حدود ۳-۴ هفته پس از واکشت ، شاخه های جدید نمایان می شوند.

دقت شود بیش از ۴ مرتبه، واکشت ها تکرار نشود چرا که سبب ایجاد جهش های ژنتیکی مثل کوتولگی، کشیدگی و …. در موز می شود. پس از اینکه تعداد ساقه های به دست آمده به اندازه مطلوب رسید، وارد مرحله ریشه زایی می شویم.

.

ریشه زایی (Rooting)

پس از مرحله ساقه زایی و به دست آوردن تعداد مناسب گیاهچه، با استفاده از جدول زیر، محیط کشت ریشه زایی را تهیه می کنیم:

.

.

سازگاری (Acclimatization)

قبل از انتقال نهال های تولید شده به زمین، باید ابتدا مرحله سازگاری را پشت سر بگذارند. به این منظور، گیاهچه هایی که دارای اندازه ریشه مناسب هستند از محیط کشت حاوی آگار جدا شده و ریشه های آن با دقت و ملایمت شستشه می شود تا کاملا از محیط کشت قبلی عاری شود، سپس داخل ظروف کوچک حاوی مخلوطی از پیت ماس، ورمی کولیت و پرلیت که دارای زهکش مناسب باشد در محیط روشن و دارای تهویه و رطوبت مناسب کاشته می شوند. فرآیند سازگاری کامل باید حدود ۲ ماه طول بکشد، یا تا زمانی که نهال ها به حدود ۲۰ سانتی متر یا بلندتر، بسته به گونه موز، قبل از کاشت مزرعه، برسند. مرحله سازگاری از مهمترین مراحل تولید نهال موز است، چرا که بخش قابل توجهی از تلفات می تواند در این مرحله رخ دهد.

.

.

هشدار: مقاله ای که مطالعه کردید، به هیچ عنوان منبع کاملی برای پروتکل کشت بافت موز و تولید نهال موز نیست و تنها راهنمایی برای کلیات تولید نهال موز به روش کشت بافت برای علاقه مندان، دانشجویان و محققان است. برای تولید در مقیاس انبوه و تجاری، نیاز به ستاپ کردن پروتکل یا خرید آن از منابع معتبر است.

.

.

منابع:

College of Tropical Agriculture and Human Resources | University of Hawaii

Tamil Nadu Agricultural University 

Core.ac.uk | Banana tissue culture: community nurseries for African farmers