استریل سازی ریزنمونه کشت بافت

استریل‌سازی ریزنمونه‌ها در کشت بافت گیاهی | روش‌ها، مواد ضدعفونی و کاربردها

کشت بافت گیاهی به‌ عنوان یکی از فناوری‌ های کلیدی در زیست‌ فناوری کشاورزی، به‌ ویژه در تکثیر گیاهان، اصلاح نژاد، تولید گیاهان عاری از بیماری و ذخیره ژرم‌ پلاسم کاربرد دارد. یکی از مراحل حیاتی و تعیین‌ کننده در موفقیت این فناوری، استریل‌ سازی اولیه ریزنمونه‌ ها (Explants) است. آلودگی میکروبی می‌ تواند منجر به شکست کل فرآیند شود؛ بنابراین آشنایی با روش‌ های علمی و صحیح ضدعفونی ریزنمونه در کشت بافت، اهمیت زیادی دارد. استریل سازی ریزنمونه کشت بافت

چرا استریل‌ سازی در کشت بافت اهمیت دارد؟

محیط‌ کشت در کشت بافت، محیطی غنی از مواد مغذی، قندها و ویتامین‌ هاست که بستری مناسب برای رشد میکروارگانیسم‌ ها نیز فراهم می‌ کند. بنابراین اگر ریزنمونه به‌ درستی ضدعفونی نشود، آلودگی‌ های سطحی یا داخلی می‌ توانند رشد کرده و مانع رشد سلول‌ های گیاهی شوند. این موضوع، اتلاف زمان، هزینه و مواد مصرفی را به همراه خواهد داشت.

روش‌ های استریل‌ سازی بر اساس نوع ریزنمونه

در کشت بافت، بسته به اینکه با بذر، برگ، مریستم، ریشه یا گل سروکار داریم، نوع تیمار و مواد ضدعفونی‌ کننده تفاوت دارند. در ادامه، روش‌ های استاندارد و توصیه‌ شده برای استریل‌ سازی انواع مختلف ریزنمونه‌ ها را معرفی و بررسی می‌کنیم:

استریل‌ سازی مریستم و جوانه‌ های انتهایی

• حساس‌ ترین بخش‌ ها به مواد شیمیایی

• مناسب برای کشت گیاهان عاری از ویروس

• مراحل پیشنهادی:

  • شستشو با آب جاری (۱۵–۳۰ دقیقه)

  • تیمار با شوینده ملایم مانند Tween-20

  • ضدعفونی با هیپوکلریت سدیم ۱–۱.۵٪ (۵–۱۰ دقیقه)

  • شست‌ و شو با آب مقطر استریل سه مرتبه

استریل‌ سازی بذرها

• بذرها منبع رایج آلودگی قارچی و باکتریایی هستند.

• مناسب برای کشت گیاهچه یا جنین‌ زایی.

• روش پیشنهادی:

  • خیساندن اولیه در آب مقطر (۲ ساعت)

  • اتانول ۷۰٪ (۳۰ ثانیه)

  • هیپوکلریت سدیم ۲٪ (۱۰–۱۵ دقیقه)

  • شستشو با آب استریل ۳–۴ مرتبه

برای بذرهای که پوست سختی دارند مانند بلوط، برخی حبوبات یا گیاهان دارویی، از اسید سولفوریک غلیظ یا آب داغ برای شکستن خواب بذر نیز ممکن است استفاده می‌ شود.

ضدعفونی برگ‌ ها

• بافت نازک و حساس

• استفاده در کالوس‌ زایی یا ریزازدیادی

• روش پیشنهادی:

  • شوینده + آب جاری

  • اتانول ۷۰٪ (۳۰ ثانیه)

  • هیپوکلریت سدیم ۱–۲٪ (۱۰–۱۲ دقیقه)

  • شست‌ و شو با آب استریل

ضدعفونی گل‌ ها و جوانه‌ های گل

• مستعد آلودگی قارچی

• استفاده برای کشت کالوس یا آنالیزهای جنینی

• روش پیشنهادی:

  • اتانول ۷۰٪ (۳۰ ثانیه)

  • کلرید جیوه ۰.۱٪ (۲–۴ دقیقه)

  • شست‌ و شوی کامل با آب مقطر استریل

استریل کردن ریشه‌ ها و ریزوم‌ ها

• دارای آلودگی‌ های عمقی و سیستماتیک.

• مقاوم‌ تر نسبت به مواد استریل‌ کننده.

• روش پیشنهادی:

  • شستشو با آب و شوینده

  • هیپوکلریت سدیم ۲–۲.۵٪ (۱۵–۲۰ دقیقه)

  • در موارد خاص، کلرید جیوه یا کلسیم هیپوکلریت.

مواد رایج ضدعفونی‌ کننده در کشت بافت

“مرجع کشت بافت گیاهی ایران برای مطالعه جدیدترین مقالات “

منابع

1.  George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G.-J. (2008).
   Plant propagation by tissue culture (3rd ed., Vol. 1 & 2). Springer.
   https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4020-5005-3
2. Trigiano, R. N., & Gray, D. J. (2016).
   Plant tissue culture, development, and biotechnology. CRC Press.
   https://www.routledge.com/Plant-Tissue-Culture-Development-and-Biotechnology/Trigiano-Gray/p/book/9781466585922
3. Cassells, A. C. (2012).
   Pathogen and biological contamination management in plant tissue culture: phytopathogen detection and elimination. In: Jain, S.M. & Ochatt, S.J. (Eds), Protocols for in vitro propagation.
   Springer.
   https://doi.org/10.1007/978-1-61779-817-3_10
4. Rout, G. R., & Das, P. (2002).
   Recent trends in the biotechnology of ornamental plants: A review. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, ۷۱(۱), ۱–۲۳.
   https://link.springer.com/article/10.1023/A:1015657106784