جداسازی ‏DNA‏ و ‏RNA‏

جداسازی DNA و RNA

جداسازی DNA و RNA توسط ژل آگارز الکتروفورز

ژل آگارز روشی است که بطور معمول برای جداسازی پروتئین ها­، DNA یا RNA  مولکولهای اسید نوکلئیک به کمک اندازه از هم جدا می شوند، یک میدان الکتریکی که در آن مولکولهای با بار منفی به سمت آند حرکت می کنند (مثبت) و این ملکول­ها فقط بر اساس وزن مولکولی در داخل ژل حرکت می­کنند به شکلی که مولکول­های با وزن کم سریع تر در داخل ژل حرکت می­کنند.

علاوه بر اندازه جداسازی­، تقسیم اسید نوکلئیک با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز می­تواند یک گام اولیه برای این امر باشد پس از خالص سازی نمونه مورد نظر “باند” از ژل رنگ آمیزی شده با استفاده از یک ترانسفیلومتر UV مشاهده می­شود.

کاربرد الکتروفورز ژل آگارز در جداسازی DNA و RNA

الکتروفورز ژل آگارز دارای چندین مزیت است که سبب محبوبیت آن می­شود. به عنوان مثال­، اسیدهای نوکلئیک در طی فرایند جداسازی در ژل، اندازه شیمیایی آن­ها تغییر نمی­ کنند و ژل های آگارز را می توان به راحتی مشاهده و کنترل کرد. علاوه بر این­، نمونه ­ها قابل بازیابی و برای مطالعات بیشتر از ژل­ ها به راحتی قابل استخراج می­ باشند. مزیت دیگر استفاده از الکتروفورز ژل آگارز این است که­ نتیجه ژل را می­ توان در یک کیسه پلاستیکی ذخیره کرد و پس از آزمایش در یخچال قرار داد تا برای مشاهده مجدد از آن استفاده کرد.

 از الکتروفورز ژل آگارز به طور گسترده ای برای تخمین اندازه قطعات DNA استفاده می­ شود که بعد از هضم توسط آنزیم­ های محدود کننده قابل مشاهده است، نقشه ­برداری از محدوده DNA کلون شده در تشخیص ژنتیک مولکولی یا از طریق انگشت نگاری ژنتیکی­، تجزیه و تحلیل محصولات PCR، جداسازی DNA ژنومی­، جداسازی RNA قبل از Northern blot نیز مثال هایی هستند که به الکتروفورز ژل آگارز بستگی دارد.

نحوه مشاهده ژل آگارز

اتیدیم بروماید Ethidium bromide

اتیدیم بروماید (EtBr) رنگ رایج جهت مشاهده اسید نوکلئیک است. روش­ های نوین نحوه استفاده از اتیدیم بروماید را توصیف می­ کند. (۲،۷-diamino-10-etyl-9-phenylphenanthridiniumbromide-) برای رنگ آمیزی DNA و RNA در ژل های آگارز مورد استفاده قرار می گیرد. از EtBr نیز برای رنگ آمیزی DNA یا RNA تک رشته ای استفاده می­ شود.

تحت اشعه ماوراء بنفش­، حداکثر تحریک و انتشار فلورسانس از EtBr را می­ توان به دست آورد که از ۵۰۰- ۵۹۰ نانومتر است. قرار گرفتن  DNA­ در معرض فلورسانس UV باید به سرعت انجام شود زیرا اسیدهای نوکلئیک در اثر قرار گرفتن در معرض طولانی تخریب می­ شوند، بنابراین وضوح باند کاهش یافته و تأثیر منفی خواهد بود.

.

.

مشاهده باندهای DNA

جهت مشاهده باندهای  DNA از یک جایگزین به نام SYBR Green I که توسط Invitrogen تولید می شود می ­توان استفاده کرد. با وجود این واقعیت که  SYBR گرین گران تر است­، و ۲۵ برابر حساس تر از اتیدیم بروماید است. SYBR Safe­، نوعی از SYBR Green است که نشان داده شده است که از سطح  شفاف سازی کمی برخوردار است به علاوه SYBR Green جهش زایی و سمیت  بسیار کم تری در مقایسه با اتیدیم بروماید دارد و این موضوع دلیل محکمی بر علاقه مندی محققین در استفاده از این ماده می­باشد.

رنگ آمیزی و مشاهده DNA

از آنجا که DNA رنگ آمیزی شده EtBr در نور طبیعی قابل مشاهده نیست­، بافرهای بارگذاری شده با بار منفی هستند که معمولاً قبل از بارگیری به ژل­­، به DNA اضافه می شود که برای بارگیری بافرها بسیار مفید هستند زیرا در نور طبیعی قابل مشاهده هستند و با DNA رسوب می کنند. زایلن cyanol و Bromophenol blue دو رنگ رایج است که به عنوان بافر بارگیری از آنها استفاده می شود.

اگر برخی از باندهای پس از جداسازی اندازه در ژل آگارز برای خالص سازی در نظر گرفته شده اند­، تجزیه و تحلیل های بیشتر­، توصیه می­شود  و از قرار دادن ژل در معرض  نور UV خودداری کنید. به عنوان جایگزین، می توان از یک منبع تحریک نور آبی استفاده کرد.

.

 مشکلات ایجاد شده در فرآیند الکتروفورز و جداسازی DNA و RNA

مشکل: اسمیر شدن باندها ممکن است به دلایل زیر رخ دهد:

۱- تجزیه شدن DNA توسط نوکلئازها

۲-شرایط نا مناسب الکتروفورز

۳- اثر GEL SHIFT

۴- بارگزاری بیش از اندازه DNA

۵- غلظت بالای نمک در نمونه

۶- شکل­گیری نامناسب چاهک های ژل

مشکل:‌ باقی ماندن DNA در چاهک

دلایل احتمالی:

۱-شکل گیری نا مناسب چاهک های ژل

۲-بارگیری بیش از اندازه DNA

۳-آلوده شدن نمونه DNA

۴- اثر GEL SHIFT

مشکل:‌ باندهای منحنی شکل DNA

دلایل احتمالی:‌

۱-ژل به طور کامل در بافر الکتروفورز قرار نگرفته است.

۲-حجم نمونه ها کم می باشد.

۳-شرایط عمل الکتروفورز نامناسب است.

۴-حباب ها و یا ذرات بزرگی در چاهک های ژل و یا خود ژل موجود می باشند.